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　　任何生物制品工艺开发的主要目标都是可重复的工艺，生产出符合所有质量属性验收标准的高质量产品。对于非ADC生物制剂，这包括先前观察到会影响产品功效或安全性的许多属性，包括产品ag基因、片段、电荷异构体、氧化变体、杂质（宿主细胞蛋白、DNA等）、产品浓度、效力等。其他质量属性对于ADC也很重要，例如载药量和一致性以及无残留（未偶联）药物的水平。

　　ADC偶联工艺的开发重点通常集中在表40.1中描述的质量属性上，因为这些属性在偶联过程中受到直接影响，并且通常是ADC最难控制的。DAR可以说是ADC最重要的属性，因为它直接影响安全性和有效性，因此应控制在适当窄的规格以确保产品的一致性。对于不使用特定位点共轭的ADC平台来说，实现严格的DAR控制尤其具有挑战性。还必须控制DAR物种分布，因为可以达到相同的平均值，但不同的亚群包含更高和更低的药物载量。游离（未偶联）药物也是一个关键属性，因为这种杂质不会选择性地递送至治疗靶点，因此会在不增加功效的情况下导致全身毒性。大小变体（包括聚集体和片段）是ADC和非ADC生物制剂的重要产品变体，但由于溶剂的使用和许多所用小分子药物的疏水性，在偶联过程中控制起来尤其困难。最后，在ADC制造过程中可以加入升高的溶剂水平以溶解药物，因此将残留溶剂去除到可接受的水平通常是ADC工艺的开发重点。

　　表40.1关键ADC产品质量属性摘要，这些属性是许多ADC平台和制造工艺的主要开发重点

　　ADC的偶联通常在专门建造的设施中进行，用于高效化合物，利用在单独工艺中制备的抗体和药物中间体（即前体）（图40.3）。这使得现有的制造设施可用于生产抗体中间体。分离抗体和ADC制造过程增加了供应链的长度和复杂性，但具有明显的优势，即在偶联过程之前控制中间体的质量。这可以防止由于抗体或药物批次质量较低而导致偶联过程中可能发生的潜在失败，从而避免与偶联原材料损失、植物时间或延迟时间表相关的重大成本。这种方法的其他好处包括它简化了ADC生产工艺和控制系统，并提供了将偶联批次大小与抗体生产规模分离的灵活性。

　　图40.3一种典型的ADC产品供应链，其中抗体和小分子药物作为中间体生产和释放，然后在ADC原料药生产过程中偶联。

　　或者，可以在单个端到端生产设施中结合抗体中间体和偶联工艺。该策略可以通过避免在纯化和偶联过程中复制某些单元作（例如UF/DF）来减少所需的制造作总数。在偶联前避免长期储存抗体中间体也有好处。然而，端到端ADC工艺需要匹配的抗体中间体和偶联量表，这在开发的早期阶段将具有挑战性，尤其是在药物供不应求的情况下。此外，由于该产品的高效性，大多数现有生物制剂生产设施都无法进行端到端ADC制造。随着ADC领域的成熟，端到端抗体生产和偶联工艺的开发可能会增加，并且有更多的开发和商业化生产项目来证明对这种方法的投资是合理的。

　　抗体中间体的质量显着影响最终ADC的产品质量，既通过直接赋予ADC一些属性（例如，在上游工艺中控制的宿主细胞蛋白和DNA等杂质，因为它们通常不受偶联过程的影响）和影响偶联反应的性能。因此，优选使用高纯度和特征良好的抗体。

　　抗体中间体通常经过纯化并释放到与传统（非ADC）抗体疗法相当的规格。对于用于下游偶联的抗体中间体，更广泛的释放标准可能适用于某些不会显着影响偶联反应的属性。例如，抗体中间体的抗体浓度或pH值的可接受范围可以更宽，因为这些属性可以在偶联过程中进一步调整。相反，用于下游偶联的抗体中间体可能需要对某些属性有更严格的验收标准。例如，优选抗体中间体中聚集体的狭义接受标准，因为在偶联过程中可能会形成额外的聚集体。如果抗体已经作为具有更广泛接受标准的非偶联疗法生产，则可能需要进行批次选择，以选择能够确保可接受的ADC产品质量的批次。

　　严格控制抗体中间体与抗体偶联位点相关的属性尤为重要。如果抗体中间体制造工艺了解并严格控制抗体中间体变异性的潜在影响，则可以实现更简单、更稳健的偶联过程。例如，三硫键的存在已被证明会改变制备链间半胱氨酸ADC时所需的反应化学计量。同样，抗体中间体中不同水平的游离硫醇会导致该ADC平台形式的DAR变异性。可以想象，C端赖氨酸水平或糖基化模式的变异性可能会对其他ADC平台产生类似的影响。

　　在开发过程中还必须考虑抗体中间体的配方。如果可能，应根据与预期ADC平台的兼容性来选择抗体制剂赋形剂，例如，如果ADC过程的第一步是赖氨酸（即伯胺）定向偶联化学，则避免使用含胺的缓冲液系统。

　　由于ADC中使用的强效药物的性质多种多样，这些分子的制造工艺存在显著差异，包括使用全合成和半合成路线。无论采用何种生产资料，药物都必须是可合成量较多且纯度高的。此外，药物必须在中间储存条件下保持稳定，直到在偶联过程中使用。

　　尽管小分子药物在技术上被归类为ADC偶联过程中的中间体，但它通常被认为是ADC的“先导化合物”，因为它主要负责产品的功效和毒性。因此，药物中间体的工艺控制和释放规范与小分子原料药相当。与传统的小分子一样，纯度/杂质曲线是药物中间体最重要的质量属性。然而，小分子中间体中的杂质可以根据共轭中使用的反应官能团的存在与否进一步分类为“可共轭”或“非共轭”。将药物中间体中的可共轭杂质控制在可接受的水平是至关重要的，因为在ADC偶联后，它极难定量且几乎不可能去除含有可偶联杂质的产物变体。

　　与抗体中间体类似，一些对小分子API至关重要的质量属性对于小分子药物中间体并不重要，因为在ADC偶联过程中会进行额外的加工。例如，ADC偶联工艺通常利用有机溶剂溶解药物中间体，因此包括具有高溶剂去除能力的工艺步骤（例如，切向流过滤）。因此，与API可接受的溶剂相比，小分子中间体中可以容忍更高水平的残留溶剂。同样，如果在偶联反应步骤后证明清除率一致，则非偶联杂质水平升高可能是可以接受的。最后，小分子中间体的物理属性通常不如传统API重要，因为偶联过程的第一步是将中间体溶解在有机溶剂中。只要药物中间体在所选溶剂中充分溶解，那么多晶型物、粒径和溶解时间就不太可能成为关键的材料属性。

　　ADC偶联过程相对独特，因为它涉及处理大分子生物药物和小分子药物。如上所述，这些通常作为ADC偶联过程的表征良好的中间体提供，只需要相对简单的化学成分即可形成ADC。该工艺旨在控制共轭反应，并将所有残留的工艺中间体和产生的杂质去除到可接受的水平。尽管存在用于生产ADC的ADC平台和偶联化学物质，但制造过程可以分为三个不同的阶段，这些阶段在大多数ADC平台上都是一致的（参见上图40.3）：

　　第1阶段：抗体功能化：此阶段在不同ADC平台之间的差异最大。通过为每个抗体产生所需数量的反应位点来制备抗体以进行偶联，最常见的方法是还原、还原/再氧化或使用双功能接头进行修饰。为了实现下游偶联反应所需的条件，还可以执行额外的调整步骤，可能包括改变池的浓度、pH值、温度、溶剂水平或缓冲液组成。

　　第2阶段：偶联反应将小分子药物溶解在有机溶剂中，并添加到抗体溶液中以形成ADC。通常，将药物过量添加到抗体反应性基团中，以确保完全偶联。根据偶联反应的化学性质，可以在偶联反应后进行淬灭步骤。

　　第3阶段：纯化和制剂对ADC进行纯化，以去除偶联后可能存在的过量药物、工艺相关杂质和产品变体。超滤和渗滤（UF/DF）通常用于在偶联后去除小分子杂质，也是配制ADC原料药的标准单元作。根据抗体和药物的分子特性，在UF/DF之前可能还需要进行额外的纯化。

　　ADC制造过程每个阶段所需的复杂性和步骤数可能会因ADC分子的设计和偶联反应化学而有很大差异。以下部分详细介绍了每个阶段中工艺开发和制造的具体注意事项。

　　在ADC制造过程的“功能化”阶段，抗体上会产生反应基团，随后可以直接与药物（或与联合连接子-药物）偶联形成ADC。对于许多ADC工艺，抗体功能化步骤是制造过程中最关键和最敏感的步骤，因为它们直接控制药物附着的数量和位点。因此，实现目标DAR的过程鲁棒性是这些步骤的重要开发重点。

　　抗体功能化步骤因ADC的设计而异，但通常包括在抗体上产生游离硫醇的还原反应或添加异双功能连接子的修饰反应。在抗体功能化过程中，可能还需要缓冲液交换步骤，以便在反应步骤之前去除不相容的buffer物种或过量的试剂。对于某些ADC平台（例如，与非天然氨基酸偶联），抗体已经功能化以进行偶联，因此抗体功能化只需要调整到所需的反应条件。

　　图40.4比较了本章重点介绍的三种ADC平台的抗体功能化阶段。对于赖氨酸定向ADC，加入异双功能交联剂，如SMCC（琥珀酰亚胺基4-（N-马来酰亚胺基）环己烷-1-羧酸酯）、SPDB（N-琥珀酰亚胺基-4-（2-吡啶基二硫代）丁酸酯）或SPP（N-琥珀酰亚胺基-4-（2-吡啶基二硫代）戊酸酯）与抗体的表面暴露赖氨酸反应。在许多情况下，在修饰反应之前，抗体通过UF/DF交换到新的缓冲液中，以提供对修饰反应条件的额外控制，并去除与接头化学不相容的缓冲液组分。在用交联剂修饰抗体后，需要额外的缓冲液交换步骤，以在偶联之前去除多余的交联剂。对于链间半胱氨酸ADC，添加有限量的还原剂以减少所需的二硫键数量。还原后，在偶联之前通常不需要缓冲液交换步骤，因此还原的抗体可以立即准备好进行偶联。最后，对于THIOMAB药物偶联物平台，首先使用显着过量的还原剂完全还原THIOMAB抗体，以去除工程半胱氨酸中的所有半胱氨酸和谷胱甘肽“帽”，这也减少了部分或全部链间二硫键。然后使用UF/DF将还原的抗体进行缓冲液交换，以去除多余的还原剂和游离的“帽”。然后添加脱氢抗坏血酸（dHAA）等氧化剂以促进链间二硫键的重新形成，从而使工程半胱氨酸成为唯一剩余的用于偶联的游离硫醇。我们发现，只要避免变性条件（例如高温），抗体亚基在整个还原和氧化步骤中保持组装状态，因此该过程不会产生高水平的片段。只要氧化剂（例如dHAA）与偶联反应化学和药物相容，就不需要在偶联前更换缓冲液。

　　抗体功能化过程中反应步骤所需的工艺开发和优化高度依赖于所使用的ADC平台。通常在开发过程中研究反应pH值、温度、抗体浓度、反应时间和试剂等量，但过程对这些参数变化的敏感性在ADC平台之间差异很大。例如，由于竞争副反应对功能化抗体产量的影响，使用异源功能连接子SMCC对抗体进行赖氨酸定向修饰对反应条件极为敏感。这些竞争性副反应包括接头上NHS官能团的水解，阻止接头与抗体连接，以及接头的马来酰亚胺官能团与抗体氨基酸侧链之间发生的交联反应（图40.5）。由于接头与抗体的修饰反应速率以及竞争性副反应的速率都在很大程度上取决于反应的pH、温度和抗体浓度，这些参数必须经过优化并严格控制，以实现一致的接头数量，并最终为每个抗体添加的药物数量一致。

　　图40.5用于一些赖氨酸定向药物偶联物中的异双功能连接子SMCC。显示了目标和潜在的副反应，突出了在工艺开发过程中面临的挑战，即建立工艺靶标和控制范围以实现所需偶联物的可重复性。

　　相比之下，用于偶联ADC的其他一些反应化学试剂对反应条件的变化不太敏感。例如，对于链间半胱氨酸ADC，生成的游离硫醇数量直接取决于还原剂的使用量，并且在典型制造过程的过程控制能力中，与其他过程参数（如反应pH值、时间和温度）相当无关。因此，链间半胱氨酸ADC的一个重要开发重点是确定所需的还原剂量并确保在制造过程中准确添加，但在还原过程中较少关注其他工艺参数。同样，THIOMAB抗体的设计为抗体功能化步骤提供了一定程度的固有稳定性，因为添加过量的试剂以完全还原然后完全再氧化抗体，即使工艺参数存在一些变化，也能产生一致数量的偶联位点。

　　在抗体功能化步骤中获得的产量通常也取决于所选的ADC平台，这主要是由缓冲液更换和过滤步骤中的产物损失驱动的。因此，相对简单的链间半胱氨酸定向偶联过程预计具有95%-100%的上游产率，因为在反应步骤中预计不会产生产物损失。相比之下，对于需要1到2次缓冲液交换和额外过滤（转移）的更复杂的平台，预计产量会降低85%–95%。

　　尽管抗体功能化步骤的工艺各不相同，但多个ADC平台仍遇到了一致的挑战。下面提供了开发和扩大抗体功能化步骤的一些典型挑战和注意事项。

　　在ADC制造过程中，试剂通常以预定义的摩尔比（即摩尔当量）与抗体添加，在某些情况下，这些添加的准确性对于实现所需的DAR至关重要。例如，在链间半胱氨酸ADC工艺中，产生的游离硫醇的可用数量与添加的还原剂成正比。因此，还原剂添加中5%的误差转化为DAR的变化约5%。因此，在全面生产过程中尽可能准确地添加试剂至关重要。

　　考虑到基于摩尔比的添加的制造变异性的众多潜在来源，包括抗体和试剂量的潜在误差，在试剂添加中达到所需的准确度水平可能具有挑战性。可变性的潜在来源及其对典型全规模过程的可能贡献程度估计如下：

　　鉴于后期开发ADC的DAR规格可能窄至±10%，试剂添加过程中的综合误差可能会将DAR推向故障极限。这尤其成问题，因为其他工艺变异性来源也会影响DAR，包括试剂纯度和反应步骤的参数。因此，需要准确添加试剂，以最大限度地提高工艺稳健性。

　　通过实施这些策略以尽可能严格地控制试剂添加的各个方面，可以常规添加的目标摩尔比的几个百分比以内的试剂。

　　与抗体功能化步骤的许多方面一样，稳健生产所需的试剂添加精度取决于所选的ADC平台。赖氨酸定向反应化学要求试剂添加的准确性最高，因为DAR与添加的试剂量直接相关，并且修饰反应受反应条件的严重影响，因此出错的可能性较小。相比之下，THIOMAB偶联过程不会受到试剂添加量微小变化的显著影响，因为添加高摩尔过量是为了推动反应完成。因此，添加试剂量的微小变化不会影响DAR，从而实现本质上更稳定的全面生产。不同ADC平台的工艺控制要求的这种差异凸显了ADC分子的设计如何定义工艺开发和放大过程中遇到的一些挑战。

　　对于某些ADC，最终产物是抗体的异质混合物，其中包含每个分子偶联的药物数量（又称DAR物种组成）和药物附着位点的进一步变异性（又称位置异构体）。这种水平的产品异质性对于某些ADC平台是预期的，并且已被证明是可接受的；ADCETRIS和KADCYLA本质上都是异质性的。然而，ADC亚群之间的安全性、有效性和PK特征可能有所不同。因此，从临床前材料到商业材料，在每批材料中实现物种的一致分布非常重要，包括DAR物种组成和位置异构体。ADC异质性最终在工艺的抗体功能化阶段得到控制，因为这些步骤定义了抗体上偶联位点的数量和位置。

　　赖氨酸定向ADC具有显著的分子异质性，因为抗体上有40+赖氨酸可用于偶联。结果是ADC包含0到9种药物，每种抗体在多个潜在位点偶联，从而在最终产品中增加数百万个独特物种。然而，尽管存在这种程度的固有异质性，偶联产物仍可能具有很高的批次间一致性。先前已经证明，对于KADCYLA，DAR形式的组成类似于以平均DAR为中心的泊松分布，使用一系列工艺条件和规模在KADCYLA制备之间获得一致的组成。

　　图40.6在相似的加工条件下，使用七种不同的抗体制备的链间半胱氨酸ADC的近似DAR物种组成和位置异构体水平，目标平均DAR为3.5

　　使用IgG1抗体制备的链间半胱氨酸ADC主要包含每个抗体连接的0、2、4、6或8种药物，具体取决于四种链间二硫键中的多少被还原（图40.6）。作为异质性的第二级，产生位置异构体取决于还原发生在铰链区域还是在Fab区域。先前已经证明，在受控还原条件下，Fab区链间半胱氨酸相对于铰链区链间半胱氨酸优先还原。这提高了图40.6中总结的ADC的近似DAR物种组成，平均DAR为3.5，该指标已被证明在该平台内的不同抗体中相对一致。

　　图40.7使用一系列参数生产的链间半胱氨酸药物偶联物的DAR物种组成，如表40.2所述

　　上述产品异质性数据是使用仅在目标条件下运行的偶联过程产生的。我们进一步评估了DAR的种类组成和位置同分异构体水平在一个给定抗体的大范围工艺参数（表40.2）。)。图40.7显示了DAR物种组成与平均DAR的函数关系，该结果是对改变反应pH、温度、持续时间、抗体浓度和还原剂量的工艺条件进行多变量研究的结果。将这些结果与从仅改变还原剂摩尔过量产生的偶联物中获得的对照数据集进行比较（实线）。正如预期的那样，具有较高平均DAR的偶联物富含高DAR形式（DAR4、6和8），而具有较低平均DAR的偶联物含有高水平的低DAR形式（DAR0和2）。值得注意的是，DAR物种组成主要由平均DAR定义，考虑到所研究的广泛工艺参数范围，这是显着的。对于任何DAR形式，实验结果与预测组成（实线）之间观察到的最大差异为3%，表明控制平均DAR也会影响DAR物种组成。还使用先前发表的方法测定了这些样品的位置异构体[51]，这表明在如此广泛的工艺条件下，位置异构体与平均DAR相似（数据未显示）。每个DAR形式的实验确定水平与基于目标反应条件下共轭的预测水平之间的最大差异为7%。这些结果表明，对于链间半胱氨酸ADC，实现一致平均DAR的过程控制范围也将确保DAR物质组成和位置异构体控制在一致的水平。

　　表40.2多变量研究中测试的工艺参数范围，用于评估工艺参数变化对所得ADC的DAR物质组成（图40.7）和位置异构体水平的影响

　　与上述来自固有异质性ADC的示例相比，许多定点导向的ADC平台是天然同质的，因为偶联主要针对目标位点。因此，由于DAR物种组成和位置异构体的一致性被设计到产品中，因此可以简化工艺开发和放大。获得均一ADC产物的另一种策略是在偶联后纯化所需的DAR形式。然而，由于会产生大量的产量损失，以及在制备规模上实现必要分离度的挑战，这种策略对于常规生产来说可能不可行。

　　抗体功能化步骤的另一个考虑因素是进料原材料（包括抗体和试剂）的变异性对反应步骤的影响程度。如果反应化学计量对产品质量至关重要，则试剂纯度会对工艺产生直接影响，在这种情况下，试剂储备液的制备应补偿试剂的纯度。由于生物制品的大小和固有的变异性，抗体对反应步骤的潜在影响可能更难以预测。因此，在开发过程中需要付出大量努力来了解抗体中间体产生的工艺变异性的潜在来源，并在生产过程中对相关属性建立充分的控制。

　　一个这样的例子是抗体三硫化物对链间半胱氨酸ADC生产过程中使用的部分还原反应的影响。三硫化物是抗体中天然存在的产物变体，在细胞培养过程中可以产生不同水平，具体取决于培养条件。抗体中间体中的三硫化物水平可以显著影响链间半胱氨酸ADC的ADC产生，因为需要两摩尔当量的还原剂（例如，三（2-羧乙基）膦（TCEP）或二硫苏糖醇（DTT））来完全还原三硫化物键并产生两个游离硫醇进行共轭，而完全还原二硫键需要一个当量的还原剂。因此，对于含有三硫化物的抗体，产生偶联所需游离硫醇数量的总体反应化学计量会发生变化。对于图40.8中给出的示例，由于存在~7%的三硫化物，使用预定量的TCEP作为还原剂时，使用抗体批次#3与抗体批次#1相比，DAR将降低约0.6。因此，抗体引入的工艺变异性可能足以导致DAR不符合释放规范，具体取决于三硫化物变异性的大小。

　　一旦了解了中间体工艺变异性的潜在来源，就可以采取各种策略来确保稳健性。在上述三硫化物水平可变的例子中，额外的细胞培养开发可能会产生持续的三硫化物水平，或者可以调整每个抗体批次中使用的还原剂量，以考虑三硫化物水平的变异性。关键步骤是确保在开发过程中识别和了解潜在的变异性来源，以便能够实施缓解战略。

　　抗体功能化后，该过程的下一阶段是偶联反应以形成ADC分子。与ADC平台之间差异很大的抗体功能化相比，根据我们的经验，许多ADC平台的偶联反应阶段相对一致。尽管存在这种一致性，但在偶联反应阶段仍存在独特的开发挑战，因为它是小分子和生物制剂制造之间的交叉点，也是有毒和无毒中间体结合形成ADC的点。

　　假设药物中间体以固体粉末形式生产，第一步是制备要添加到偶联反应中的药物储备溶液。由于ADC中使用的许多小分子药物具有疏水性和低水溶性，因此有机溶剂通常用于药物溶解。也可以将低水平的有机溶剂作为助溶剂添加到抗体溶液中，以在整个偶联过程中保持药物溶解度（图40.9）。将药物溶液添加到制备的抗体中导致偶联形成ADC。通常，在可用的抗体偶联位点上添加过量的药物，以确保偶联反应完成。偶联完成后，偶联的时间将取决于偶联反应的动力学，一些过程将利用淬灭步骤来防止抗体与任何残留的无残留药物在纯化前发生副反应。淬火可以通过调节pH值、添加淬火试剂或其他方式来实现。

　　用于偶联的药物量（即药物：Ab摩尔比）通常是开发过程中需要研究的关键参数，因为在项目的开发阶段，药物通常生产成本高昂且供应短缺。药物添加不足会导致未反应的偶联位点残留在Ab上，平均DAR较低，而过度添加会浪费有价值的药物，可以而且可能导致某些化学试剂的脱靶偶联。

　　另一个关键的开发决策是选择用于药物初始增溶的溶剂，并可能作为偶联反应溶液中的助溶剂以保持药物溶解度。使用的溶剂可能因药物的性质、抗体和正在进行的反应而异，但最常见的是选择极性非质子溶剂，例如二甲基亚砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMF）或N，N-二甲基乙酰胺（DMA）。或者，如果证明可有效溶解所选药物，则可以使用更蛋白质友好的溶剂，例如丙二醇。对所选溶剂的要求通常包括溶剂能有效溶解药物、惰性、水溶性、在低浓度下与蛋白质相容，并且具有适当的高闪点，可用于非防爆设施。

　　对于偶联反应开发，目标是将可用的抗体官能团与药物充分反应以形成ADC，同时最大限度地减少聚集体的形成，最大限度地减少脱靶偶联（取决于反应化学），并实现药物的高效使用。在开发过程中研究的典型参数是反应pH值、温度、抗体浓度、反应时间、溶剂选择、溶剂百分比和添加药物的摩尔当量。下面描述了在共轭阶段遇到的挑战示例。

　　在偶联反应步骤的工艺开发过程中，了解相对于抗体中其他氨基酸官能团的偶联靶位点化学选择性非常重要。限制脱靶偶联通常是一个焦点，因为它对产品质量和稳定性都有潜在影响。脱靶偶联的倾向取决于所使用的反应化学成分以及工艺条件。

　　先前已报道过利用NHS接头化学的赖氨酸定向ADC脱靶偶联的一个例子。尽管NHS对伯胺具有选择性以形成酰胺键，但也存在与丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸酸的副反应，形成相对不太稳定的乙酰化偶联物。这些不太稳定的键会随着时间的推移在溶液中水解，从偶联物中释放出接头和药物，从而影响ADC产物的平均DAR和游离药物水平。此外，与赖氨酸以外的氨基酸偶联会给产物增加额外的异质性，必须进行可重复的控制。

　　图40.10偶联反应时程研究显示，当在接头药物上使用马来酰亚胺官能团时，形成一种新的“奇数DAR”物质，该物质在链间半胱氨酸ADC的预期4和6 DAR形式之间洗脱

　　当使用马来酰亚胺反应化学与抗体半胱氨酸反应时，也会出现脱靶偶联，包括链间半胱氨酸ADC和THIOMAB药物偶联物。与抗体其他官能团的潜在副反应相比，马来酰亚胺官能团与游离硫醇反应具有高度选择性。然而，如果在偶联过程中过量添加含马来酰亚胺的药物（这通常在ADC生产过程中出现），那么一旦消耗了可用的游离硫醇，不良的脱靶偶联将成为主要反应。下面提供了链间半胱氨酸ADC平台的非特异性马来酰亚胺偶联的示例，该平台生成主要含有偶数DAR形式的偶联物。然而，在过程稳健性研究中，观察到偶联时间的延长导致奇数DAR形式的水平升高，最突出的是明显的5-DAR形式，增加了平均DAR并显着改变了DAR物种组成（图40.10）。这些变化被证明是含马来酰亚胺的药物与抗体赖氨酸的非特异性偶联。然而，在较低的反应pH值下，脱靶偶联反应的速率明显较慢，这由5-DAR物质的形成速度较慢表明（图40.11）。在较低pH值下，脱靶偶联反应的动力学较慢，这意味着生产作更加稳健，避免了在某些步骤中短暂延迟生产可能导致由于该变体水平升高而导致批量剔除的风险。预计其他反应化学品也会面临类似的反应特异性挑战，尤其是在开发的后期阶段，需要成为重点，以确保工艺的稳健性。

　　图40.11“奇数DAR”物质（5DAR形式）的普遍性与反应pH值和时间的关系，与含有马来酰亚胺的连接药物偶联的链间半胱氨酸ADC的函数关系。

　　偶联反应开发和放大过程中的一个关键目标是控制聚集体的形成，聚集体是关键的质量属性，因为它们对生物制品的安全性和有效性有潜在影响。在共轭下游实现聚集体去除步骤既具有挑战性又成本高昂，因此，首选是将聚合保持在可接受的水平，以便不需要删除共轭后。生物制品中聚集体生成的诱导因素已被广泛研究，包括高温、剪切应力、高蛋白质浓度、溶剂效应和化学改性。由于抗体功能化和偶联过程中天然蛋白质结构的破坏（例如，链间半胱氨酸还原）、极疏水性药物分子的附着以及制造过程中溶剂的使用，ADC可能特别容易受到聚集门控的影响。毫不奇怪，对于某些ADC来说，聚集体形成的倾向高于相应的未偶联门控抗体。聚集体形成的倾向取决于抗体、药物和接头的特性，以及依赖于ADC平台。

　　在ADC加工过程中，有多种潜在的方法可以限制聚集体的形成，从修改接头药物到改变偶联反应参数。在ADC偶联过程中减轻聚集体形成的策略将取决于正在形成的聚集体类型，这些聚集体可以大致分为两种类型：作为ADC反应化学的副产物产生的共价聚集体，以及在过程中由其他应力产生的聚集体，与所使用的反应化学没有直接关系（例如，高温、剪切、高溶剂）。

　　共价聚集体的一个例子来自THIOMAB平台，其中二硫键连接的聚集体可以在偶联之前通过工程半胱氨酸形成。同样，在使用异双功能接头SMCC修饰抗体后但在偶联之前，衍生化抗体包含反应性马来酰亚胺，该反应性马来酰亚胺可与其他抗体生成共价聚集体。在这两种情况下，降低蛋白质浓度、降低溶液pH值并最大限度地减少保持时间将最大限度地减少聚集体的形成。然而，防止共价聚集门形成的策略通常是平台和化学特异性的，并且需要针对特定产品的开发。

　　用于生产ADC的疏水性药物可能会驱动非共价聚集。设计小分子药物以降低ADC的整体疏水性可以提高药物的水溶性并限制ADC聚集。然而，由于这种方法也可能影响偶联物的安全性和有效性，因此通常不会纯粹为了制造利益而应用。或者，偶联过程的其他方面可能有助于非共价聚集，包括在过程中使用高温、快速混合速率（即高剪切力）或高浓度的有机溶剂。Hollander等研究了在制备卡连奇霉素偶联物过程中使用添加剂（包括洗涤剂、醇类、氨基酸、脂肪酸和溶剂）来防止聚集的情况，发现使用乙二醇和辛酸的混合物进行偶联可产生最小的聚集体。然而，尚不清楚聚集的减少是由于接头药物在该溶液中的溶解度增加、偶联前溶液相卡利奇霉素结合之间的关联发生变化，还是其他一些因素。

　　聚集体的形成也会受到过程中使用的工程参数的影响，例如试剂添加速率、混合速率或其他剪切应力来源。对于一个ADC过程，我们观察到当该过程以缓慢的药物添加速率和最小的搅动进行时，聚集物质水平增加（图40.12）。这些结果表明，该抗体暴露于含有高溶剂浓度或高药物浓度的局部环境中会诱导聚集体形成。

　　图40.12使用慢速、目标速度或快速添加药物（制备为100%有机溶剂中的储备溶液）进行偶联产生的聚集体水平和SEC-HPLC曲线

　　偶联后通常存在游离药物和溶剂，需要纯化和制剂步骤才能生成ADC原料药。超滤/渗滤（UF/DF）是缓冲液交换生物产品（包括ADC）的标准方法。UF/DF膜具有一系列标称截留分子量（NMWCO），包括5、10或30kDa，这使得这些步骤能够有效地保留产品，同时去除许多低分子量杂质，包括潜在的溶剂、游离药物和药物相关杂质。图40.13显示了UF/DF对“表现良好”ADC的溶剂和残留游离药物的代表性清除率，它证明了去除两种杂质的近乎理想的筛分系数（S=1）。（在非常低的浓度下，溶剂去除变得不理想，这可能是由于溶剂从膜中的反弹效应，或者是由于UF/DF系统的溶剂与塑料成分之间的相互作用）。在UF/DF有效去除偶联反应中残留的所有杂质到可接受水平的情况下，如本例中所示，UF/DF可能是偶联下游唯一需要的纯化步骤。

　　图40.13 UF/DF作过程中的杂质清除率作为去除（A）残留溶剂和（B）游离药物的直径的函数

　　与上述示例相比，UF/DF可能无法清除游离药物和游离药物相关杂质，用于不太“表现良好”的ADC工艺。即使杂质的分子量明显低于UF/DF膜的NMWCO，也可以观察到这种情况。图40.14显示了在使用30kDaNMWCO膜的UF/DF过程中两种分子量均为2kDa的游离药物相关杂质的清除行为。一个特异性杂质A穿过UF/DF膜，并通过步骤被2个对数级清除，而杂质B在10个双体积的过程中没有明显清除。在UF/DF期间游离药物滞留的机制目前尚不清楚，但可能部分是由于药物的自身缔合增加了其在水性环境中的表观大小，或者游离药物与ADC之间的非特异性相互作用。如果UF/DF步骤无法将游离药物和相关杂质清除到可接受的水平，则需要其他纯化步骤，其中可能包括色谱纯化（参见下面的案例研究）或通过活性炭过滤吸附游离药物。除了去除游离药物外，如果偶联反应产生无法接受水平的产物变体或聚集体，则可能需要对ADC进行色谱纯化。

　　当UF/DF成功清除溶剂和游离药物种类，并且不需要去除产品变体时，对于遵循标准UF/DF工艺的ADC，下游纯化和制剂步骤的开发相对简单。在这些情况下，纯化和制剂步骤的预期收率相对较高，为90%–95%。以下部分提供了在单独使用UF/DF无法获得可接受的ADC产品质量的情况下开发的其他纯化作示例。除了增加工艺的复杂性外，这些额外的步骤还会显著降低工艺产量，具体取决于所采用的方法。

　　图40.14 UF/DF作期间的杂质清除数据显示为游离药物相关杂质（包括（A）杂质A和（B）杂质B）的直径体积的函数

　　结合和洗脱色谱是一种通用的从ADC中去除游离药物的方法，它利用了ADC和游离药物之间显著不同的分子特性。在这种方法中，调整包含游离药物和溶剂的偶联反应环境并将其加载到色谱柱上，该色谱柱根据离子、亲和力或与树脂的其他相互作用特异性吸附ADC，同时游离药物和残留溶剂流经色谱柱。某些填料可能与游离药物存在非特异性相互作用，因此建议进行填料筛选，并且可能需要进行洗涤步骤以确保完全去除游离药物。

　　样品色谱运行条件和代表性色谱图分别显示在表40.3和图40.15中，用于使用在结合和洗脱模式下作的阳离子交换剂从ADC中去除游离药物。在这种情况下，使用色谱柱的梯度洗脱，但也可以对产物进行阶梯洗脱。然后可以在色谱池上进行UF/DF，一旦去除了UF/DF共纯化的低分子量杂质，就可以配制原料药。

　　图40.15根据表40.3所述的条件进行阳离子交换色谱运行以去除ADC中的游离药物的色谱图

　　如本章前面所讨论的，由于对高效化合物进行大规模色谱相关的挑战以及此类步骤可能造成的产量损失，因此不首选对ADC进行色谱纯化以去除聚集体。然而，如果聚集体的产生水平对于ADC产物来说是不可接受的，则可以采用标准抗体纯化方法去除ADC聚集体。

　　高通量批量结合筛选可用于有效识别和优化抗体的纯化条件[70]。这些技术可以应用于低通量（手动）或高通量（机器人）形式的ADC工艺开发，尽管需要额外的控制措施来确保正确处理强效化合物以及设备与所需水平的有机溶剂的化学相容性。

　　CEX是从非偶联抗体中去除聚集体的标准方法，也可用于偶联不影响抗体电荷的情况下的ADC聚集体去除（例如，半胱氨酸定向偶联化学；不带电荷的连接子药物）。使用抗体及其相关ADC（链间半胱氨酸ADC格式）进行的阳离子交换（CEX）树脂筛选实验的结果如图40.16所示。抗体中间体和ADC在该CEX树脂上具有相似的结合行为（即，作为pH值和促成率的函数的相似分配系数），但在某些条件下与偶联物的结合稍强。对于该分子，连接子药物的连接不会显著影响蛋白质结合，并且可以使用与未偶联抗体类似的CEX运行条件纯化ADC。相比之下，赖氨酸定向ADC预计具有显著不同的结合行为，因为每次赖氨酸修饰都会丢失一个带电基团。作为CEX的替代方法，陶瓷羟基磷灰石纯化已被用于赖氨酸定向ADC平台去除聚集体。

　　图40.16批量吸附等值线图，显示抗体及其对应药物偶联物在阳离子交换色谱树脂上的结合行为。根据前面描述的方法绘制等高线图。

　　色谱纯化ADC时的另一个考虑因素是分离是否也会影响平均DAR或DAR物质组成，这可能取决于所选的分离模式。因此，在纯化步骤的开发过程中，除了聚集体水平外，还应监测这些产品质量属性。在开发阶段，还必须考虑溶剂和游离药物对色谱系统性能和色谱柱重用的潜在影响。

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